Nanoparticule inteligente pentru livrarea de agenți otoprotectori ai urechii interne - NANOSMART

Denumire proiect: Nanoparticule inteligente pentru livrarea de agenți otoprotectori ai urechii interne

Acronim: NANOSMART

Competiție: PNCDI III - Program 2 - Subprogram 2.1.

Cod proiect: PN-III-P2-2.1-PED-2019-3813

Echipa proiectului

Director de proiect: Conf.dr. Alma Maniu

Instituție coordonatoare: Universitatea de Medicină și Farmacie "Iuliu Hațieganu" Cluj Napoca

  1. Alma AureliaManiu- director de proiect
  2. Violeta Necula – membru cercetător
  3. Adrian Florea - membru cercetător
  4. Cristina Maria Blebea - membru cercetător
  5. Stamate Mirela Cristina - membru cercetător
  6. Ujvari Laszlo Peter - membru cercetător

Parteneri

Institutul Oncologic Prof.Dr.I.Chiricuță Cluj Napoca – P1

  1. Maria Perde-Schrepler – lider de echipă P1
  2. Virag Piroska - membru cercetător
  3. Eva Fischer-Fodor- membru cercetător
  4. Ioana-Carmen Brie - membru cercetător
  5. Marilena Vicovan – membru tehnic (statistician)

Universitatea Babeș Bolyai Cluj Napoca – P2

  1. Monica Potara – lider de echipă P2
  2. Timea Nagy-Simon - membru cercetător
  3. Simion Astilean - membru cercetător

Budget: 600.000,00 RON (2 ani)

Rezumat

Surditatea neurosenzorială reprezintă pierderea ireversibilă a celulelor neurosenzoriale cohleare, ca urmare a expunerii la zgomot intens sau medicamente ototoxice. Dexametazona (Dex) este frecvent folosită pentru tratamentul unor afecțiuni ale urechii interne, ca urmare a activității sale antioxidante. Tratamentul afecțiunilor urechii interne este dificil datorită barierelor anatomice și fiziologice. În proiectul nostru, se vor sintetiza nanostructuri noi ca platforme de livrare a Dex în urechea internă: NP de aur învelite în chitosan sau Pluronic, NP de chitosan și NP de Pluronic. Formarea NP și încărcarea cu Dex, stabilitatea acestora în diferite condiții de mediu și experimentale vor fi monitorizate prin spectroscopie UV-vis-NIR, microscopie electronică de transmisie (TEM), împrăștierea dinamică a luminii, spectroscopie în infraroșu și spectroscopie de absorbție atomică. Se vor estima de asemenea, eficiența de încapsulare și de eliberare a Dex. NP vor fi testate in vitro pe linia celulară HEI-OC1: preluarea NP de către celule se va evalua prin microscopie în câmp întunecat, în fluorescență și electronic, precum și prin spectroscopie de absorbție atomică. Efectele biologice ale NP vor fi evaluate prin teste de citotoxicitate (Alamar blue), producerea ROS (H2DCFDA), apoptoza (Anexina V și PI), producerea de citokine (ELISA). Studiul in vivo se va face pe șobolani la care se va induce surditate prin tratament sistemic cu Cisplatin. NP vor fi administrate intratimpanic. După 24h și 48h, se vor înregistra potențialele evocate auditive, iar cohleilor recoltate vor servi drept instrumente de dozare a Dex prin HPLC din perilimfă, vor fi analizate imunohistochimic, prin TEM pentru observarea afectării celulelor neurosenzoriale și localizarea NP în structurile urechii interne. Prin studiul nostru se vor obține noi nanomateriale cu potențial de utilizare ca agenți terapeutici, pe baza unor argumente științifice.

Obiectiv

Hipoacuzia senzorială reprezintă una dintre cele mai frecvente dizabilități umane, cauzată de sunete intense și medicamente ototoxice (de exemplu, aminoglicozide, cisplatină). Afectează aproximativ 1 din 10 persoane și este ireversibilă. Tratarea tulburărilor urechii interne rămâne dificilă din cauza barierelor anatomice și fiziologice. În prezent, administrarea sistemică a medicamentului este considerată prima modalitate de tratament de linie pentru tulburările urechii interne, dar aportul limitat de sânge al urechii interne și pătrunderea relativ slabă a barierei sangvine - labirintice (BLB) vor duce la concentrația locală subterapeutică a medicamentului. Injecțiile intratimpanice (IT) livrează medicamente către urechea internă prin membrana fereastrei rotunde (RWM), ducând la concentrații semnificativ mai mari de medicamente în urechea internă. Datorită limitării livrării convenționale de medicamente, a existat un interes crescut de a explora potențialul nanoparticulelor (NP) pentru administrarea intracocleară a medicamentelor. NP-urile pot fi utilizate atât pentru stabilizarea medicamentelor in vivo, cât și pentru transportarea medicamentelor în cohlee. NP-urile pot încapsula agenți terapeutici și sunt capabili să traverseze RWM. Scopul nostru este de a sintetiza nanoparticule de aur, polimerice capabile să livreze Dexametazonă (Dex) în concentrații terapeutice către urechea internă. NP-urile propuse vor fi: nanoparticule de aur acoperite cu chitosan (chit-AuNPs), nanoparticule de aur acoperite cu Pluronic (Plu-AuNPs), nanoparticule de chitosan (Chit-NPs) și nanoparticule Pluronic (Plu-NPs). Deoarece Dex este un medicament slab solubil în apă, polimerul Pluronic și biopolimerului chitosan vor fi utilizate pentru încapsulare. Ambele au proprietăți fizico-chimice favorabile pentru aplicații biomedicale: biocompatibilitate excelentă, biodegradabilitate, nu sunt toxice sau cancerigene sau imunogene având, de asemenea, efect antibacterian și un comportament dependent de pH. Aceste nanomateriale vor fi validate in vitro și modele in vivo și ar putea fi utilizate în continuare în studiile clinice.

Obiective specifice

Această propunere își propune să ofere:

- nanostructuri noi și versatile care vor livra dexametazonă în celulele senzoriale ale urechii interne in vitro și in vivo: nanoparticule de aur acoperite cu chitosan (Chit-AuNPs), nanoparticule de aur acoperite cu Pluronic (Plu-AuNPs), nanoparticule de chitosan (Chit-NPs) și nanoparticulele Pluronic (PluNPs) vor fi fabricate și utilizate ca platforme de livrare a medicamentelor;

- o evaluare amplă a transformărilor suferite de nanoparticule în setările biologice, corelate cu efectele asupra celulelor tratate: evaluarea absorbției și citotoxicității, a nanoparticulelor in vitro în funcție de concentrație, dimensiune și timpul de incubație pe celule senzoriale ale urechii interne (linia celulară HEI-OC1);

- o evaluare in vivo a efectului protector al NP-urilor injectate intratimpanic după inducerea pierderii auzului cu Cisplatin intravenos; o evaluare a efectului protector al nanoparticulelor încărcate cu Dexametazonă în comparație cu efectul Dex singur;

- extrapolarea modelelor experimentale, oferind o demonstrație experimentală pentru utilizarea acestor nanomateriale în studii clinice ulterioare, a efectelor protectoare ale acestor NP asupra celulelor senzoriale ale urechii interne, afectate de tratamente ototoxice.

Rezultate obținute în proiect

Etapa 1/2020

Elaborarea protocoalelor de sinteza a noilor nanostructuri, elaborarea protocoalelor de studiu in vitro si in vivo. Strategii de obtinere a nanoparticulelor. Protocoale experimentale

P2-UBB.
Protocoale de sinteză a noilor nanomateriale pentru livrarea Dexametazonei către urechea internă. Studiu bibliografic amplu legat de designul nanomaterialelor pentru livrarea Dexametazonei (Dex) către urechea internă, și a identificat următoarele protocoale de sinteză:

  • Micelii de Pluronic încărcate cu Dex prin metoda emulsificării
  • Nanoparticule de aur (GNP) sintetizete prin metoda Turkevich-Frens prin reducerea sării de aur cu citrat de sodiu, învelirea acestora în Pluronic și încărcarea cu Dex prin metode fizice (încapsulare, adsorbție)
  • Nanoparticule de chitosan încărcate cu Dex prin metoda de gelificare ionică
  • Nanoparticule de aur (GNP) în chitosan sintetizate într-un singur pas prin reducerea sării de aur cu chitosan și încărcare cu Dex prin metode fizice (încapsulare, adsorbție)

P1-IOCN

Elaborarea modelelor experimentale in vitro, realizarea culturilor de celule neurosenzoriale HEI-OC1. Elaborarea protocoalele de laborator pe baza carora se va desfasura studiul.

  • Mentinerea in cultura a liniilor de cellule HEI-OC1
  • Determinarea preluarii NP de catre cellule prin:
      - Microscopie electronica de transmisie TEM.
      - Spectrometrie atomica de absorbtie.
  • Evaluarea efectului NP asupra viabilitatii celulelor aparatului auditiv.
  • Detectarea apoptozei
  • Microscopie in fluorescenta
  • Evaluarea stressului oxidativ produs de NP
  • Evaluarea efectului asupra sistemului imun- secretia de cytokine inflamatorii TNFα si IL6 prin ELISA.

CO-UMF

Elaborarea protocoalelor experimentale in vivo.
Se folosesc pe post de bioreactor șobolani Wistar. Acestora li se induce ototoxicitate prin administrare intraperitoneală de cisplatin, iar apoi prin injectare transtimpanică li se vor administra atât dexametazonă simplă, cât și nanoparticule încărcate cu dexametazonă pentru a compara nivelul otoprotecției oferite de nanoparticulele încărcate cu dexametazonă împotriva efectului ototoxic al cisplatinului. Protocol de evaluare a efectelor tratamentului cu NP nou sintetizate la nivelul cohleei animalelor de experientă

  • Protocol de evaluare a ototoxicității induse de cisplatin. Stabilirea dozelor de lucru
  • Studiu: Evaluarea prin TEM a preluării NP de către animalele de experiență
  • Studiu: Evaluarea efectului protector al Dexametazonei și al NP încărcate cu Dexametazonă împotriva ototoxicității induse de Cisplatin
  • Studiu: Evaluarea prin TEM a preluării NP încărcate cu dexametazonă de către celulele neurosenzoriale la animalele de experienta

Etapa 2/2021

P2- UBB

Activitatea 2.1.1. Fabricarea nanoparticulelor de aur (GNP) cu chitosan și aur cu pluronic, înglobarea Dex și caracterizarea acestora din punct de vedere fizico-chimic. Activitatea 2.2.2. Testarea GNP pe modelele in vitro si in vivo. Evaluarea internalizarii si a efectelor biologice.
Fabricarea nanoparticulelor de aur stabilizate cu Pluronic și încărcare cu Dexametazonă

Picture 1

Activitatea 2.2 – Studiul pe culturi de celulele HEI-OC1 al efectului nanostructurilor sintetizate asupra celulelor neurosenzoriale, evaluarea preluarii NP de catre celule.
Studiul preluării NP de către celule prin absorbție atomică
Cantitatea de aur internalizată în celule exprimată procentual față de concentrația de aur incubată.Concentratia de Au detectata in celulele HEI-OC1 a fost proportionala cu concentratia de NP administrata si timpul de incubatie. Se constata o mai buna internalizare a NP cu chitosan comparativ cu cele cu Pluronic.

Studiul preluării NP de către celule prin microscopie în câmp întunecat

Screenshot 2021 12 10 at 18.43.47

Figura 3. Imagini de microscopie în câmp întunecat ale celulelor HEI-OC1 incubate cu nanoparticule și fără nanoparticule (control)

P1 – IOCN

Activitatea 2.2.3 –(CO – UMF si P1-IOCN) Evaluarea prin TEM a preluarii NP de catre celulele HEI-OC1

Picture 4

Activitatea 2.2.1.Stabilirea concentratiilor netoxice de lucru prin teste de citotoxicitate.
Acest deziderat s-a realizat prin efectuarea testului de citotoxicitate MTT utilizand dilutii seriate din solutiile de NP. Toxicitatea acestor NP a fost direct proportionala cu concentratia.

Activitatea 2.3.1 – (P1 – IOCN) Evaluarea producerii apoptozei, eliberarii de specii libere de oxigen, a producerii de citokine inflamatorii in urma tratamentului in vitro al celulelor cu NP. Eliberarea de specii reactive de oxygen (ROS). cu 2’,7’ – cu dichlorofluorescin diacetate

Screenshot 2021 12 10 at 18.51.37

Tratamentul cu NP nu a produs o crestere a eliberarii de ROS pentru nici unul din tipurile de NP studiate.

  • Apoptoza

Evaluarea procentului de celule care mor prin apoptoza in urma administrarii NP de aur cu Pluronic si chitosan incarcate sau nu cu Dexametazona s-a facut prin flow-citometrie, celulele fiind marcate cu kitul de Anexina V- Alexa Fluor 488 si iodura de propidium.

Picture 6

Analiza flow-citometrica a celulelor HEI-OC1 dupa 4h de incubatie cu GNPPlu (b), GNPPluDex (c), Dexametazona (d), AuChit (e) si AuChitDex (f) precum si a celulelor control netratate (a). Celulele au fost marcate cu Anexina V-Alexa fluor 488 si iodura de propidiu.

Secretia de citokine inflamatorii- ELISA

Se constata absenta secretiei crescute in cazul ambelor citokine dupa administrarea NP de Au in comparatie cu controlul.

CO-UMF. Studiu experimental in vivo.

Determinări funcționale audiologice

Inregistrarile ABR au fost efectuate într-o camera cu sistem de atenuare a sunetului, cu ecranare electrică, la o temperatura constanta de 23±1˚.

Screenshot 2021 12 10 at 18.56.10

Injectarea de GNP s-a realizat sub control endoscopic.S-au repetat determinările audiologice la 48 de ore post injectare. Nu au fost evidențiate diferențe între pragurile auditive după injectarea NP comparativ cu pragurile inițiale indiferent concentrații sau de stimulul auditiv folosit (click sau pure tone).

Scr10 at 18.33.28

A- rezultate ABR cu stimulare “click” înainte de administrare NP; B- ABR după administrare 40µl NP cu concentrație 100µg/ml, transtimpanic; în ambele măsurători se deceleaza unde reproductibile până la 30dB SPL.

Examen histopatologic

 Picture 7

Elementele cohleei nu prezintă modificări specifice unei reacții inflamatorii; magnificație 10X, colorație HE. 1. membrana bazilară; 2. membrana tectoria; 3. stria vascularis; 4. membrana Reissner; 5. rampa vestibulară; 6. rampa timpanică; 7. fibre nervoase

Prin faptul că nu am observat modificari ale potentialelor evocate auditiv după administrarea nanoparticulelor și de asemenea structurile urechii interne evidențiate la examen microscopic nu au suferit modificări ca reacție a unui proces inflamator, putem considera că ambele concentrații de nanoparticule pot fi folosite în siguranță în următoarea etapă a proiectului.

Diseminarea rezultatelor cercetarii

  • Articol ISI publicat in revista Molecules, factor de impact 4,41: “Zeaxanthin-Rich Extract from Superfood Lycium barbarum Selectively Modulates the Cellular Adhesion and MAPK Signaling in Melanoma versus Normal Skin Cells In Vitro”. Din lista de autori fac parte mai multi membri ai proiectului: Eva Fischer-Fodor, Alma Maniu, Maria Perde-Schrepler, Piroska Virag.
  • Articol in evaluare la o revistă cotată ISI IF=2,986 (Journal of Nanomaterials – Hindawi) cu titlul „Recent advances and future research directions for hearing loss treatment based on nanoparticles” Autori: Maximilian Dindelegan, Cristina Blebea, Maria Perde-Schrepler si Alma Maniu. Articolul a fost revizuit conform cerințelor editorilor și revizorilor și așteptăm răspunsul editorilor în legătură cu varianta revizuită a articolului.
  • Participari la manifestari stiintifice:
    Membri ai colectivului de cercetare au participat în calitate de lectori la „The International School of Experimental Microsurgery” Ed.6, curs organizat între 11-18 Iulie în Cluj-Napoca unde au sustinut doua prezentari: Alma Maniu- „Microsurgery in otology” si Maximilian Dindelegan- „Experimental microsurgery- headstart for a promising medical career”.

Consideram ca obiectivele propuse pentru aceste etape au fost indeplinite in totalitate, cu obtinerea unor rezultate valoroase care pun bazele cercetarii propuse in acest proiect. S-a obtinut sinteza unor nanoparticule proteice (Chitosan si Pluronic) incarcate cu Dexametazona care dupa ce au fost preluate de catre celulele urechii interne s-au dovedit a fi netoxice, neafectand celulele neurosenzoriale ale urechii interne. De asemenea in vivo, administrarea lor nu a produs afectarea auzului animalelor de experienta, astfel, ele vor putea fi folosite in cercetarile viitoare ca agenti de protectie impotriva ototoxicitatii Cisplatinului.

 

 

Contact
Alma Maniu, Conferențiar, Doctor în Medicină
Department ORL, Universitatea de Medicină și Farmacie Iuliu Hațieganu, Cluj-Napoca, România
E-mail: